Ghép tủy tế bào nguồn

Chuẩn bị tế bào nguồn cho ghép tuỷ

Nguồn cung cấp tế bào nguồn sinh máu (Sourse of Hemopoietic Progenitor Cells)

Tế bào có khả năng sinh máu (progenitors) đồng loài từ các người cho có cùng HLA (A, B, DR) hoặc từ chính bản thân bệnh nhân. Ở người sourse tế bào nguồn có thế phân lập từ các cơ quan sau đây (bảng).

Tuỷ xương.

Tế bào gan phôi.

Máu ngoại vi.

Máu cuống rốn.

Tuỷ xương bệnh nhân lơxêmi ở thời kỳ ổn định sau điều trị hoá chất, hoặc sau khi điều trị hoá chất có dùng chất kích thích GM, G - CSF.

Huy động tế bào nguồn từ tủy vào máu.

Nuôi cấy in-Situ (nuôi cấy dài ngày = longterm culture)

Bảng. Các Source của tế bào nguồn và khả năng cung cấp

Thu hoạch tế bào nguồn

Phân lập tế bào nguồn từ tuỷ:

Tuyển chọn người cho.

Chọc hút dịch tuỷ, thu khoảng 100 hoặc > 1000ml dịch tuỷ-chống đông.

Phân lập tế bào có nhân, tách tế bào nguồn.

Loại bỏ T lympho.

Bảo quản và sử dụng.

Phân lập tế bào nguồn từ máu ngoại vi:

Tuyển chọn người cho.

Phăn lập từ máu bằng phương pháp gạn tế bào nguổn sử dụng máy tự động.

Phân lập từ túi máu bằng ly tâm phân lớp.

Loại huyết tương.

Loại hồng cầu, loại T lympho, bảo quản ở -196°c và sử dụng.

Phân lập tế bào nguồn từ máu dây rốn trẻ sơ sinh:

Vô khuẩn trong quy trình thu gom, loại bớt HC, bảo quản ở -196°c và sử dụng.

Huy động tế bào nguồn:

Huy động tế bào nguồn bằng hoá chất kết hợp với chất kích thích G-CSF (Mobilization ofHSC by chemotherapy and G-CSF). Kỹ thuật này cho hiệu quả gấp 40 - 50 lần.

Hoá chất và chất kích thích thường dùng:

Cyclophosphamid, sau đó dùng G-CSF trên ngày thứ 4 - 6.

Thu hoạch tế bào progenitors: sau khi đã dùng G-CSF vào ngày 4 hoặc 5 thu hoạch tế bào nguồn bằng máy tự động.

Dùng chất kích thích đơn phương:

G - CSF, GM – CSF.

GF, IL-3..

Thrombopoietin.

Nuôi cấy in-situ: nuôi cấy clone bằng kỹ thuật insitu có chất kích thích.

Làm sạch tế bào nguổn

Loại T lympho:

Phương pháp miễn dịch:

Kỹ thuật sử dụng kháng thể đơn dòng chống T lympho (ATG).

E Rosette.

Miễn dịch hấp phụ (IM - adsoption).

Phương pháp dược lý: sử dụng các hoá chất + Cyclophosphamid.

Vincristin + Cyclosporin A.

Phương pháp sinh học:

Nuôi cấy dài ngày có chất kích thích T-Lympho + Hoạt hoá T lympho bằng IL-2, rồi loại bỏ tế bào T.

Loại tế bào lơxêmi sử dụng cho tự ghép tuỷ:

Nuôi cấy dài ngày: tế bào lơxêmi chết trước.

Đông tan: tế bào lơxêmi dễ bị ly giải hơn tế bào bình thường.

Loại bằng cảm ứng từ: làm sạch bằng phương pháp này có kết quả tốt, xong đắt tiền.

Bảo quản tế bào nguồn

Bảo quản bằng dung dịch DMSO (Dimethyl Sulíbside) 10% dùng dung dịch có 20% huyết tương của bản thân.

Làm lạnh: 1 - 5°c/l phút cho tói -30°c

Làm lạnh sâu: - 80°c

Âm 186°c trong nitơ lỏng (Liquid nitrogen)

Sử dụng tế bào nguồn bảo quản

Phá đông: nhanh, trong chậu nước ấm 37°c đến 40°c

Dung dịch tế bào được truyền bằng catheter qua tĩnh mạch thượng đòn.

Có thể thểm một bước trước khi truyền loại bỏ DMSO, giảm độc, nhưng thực chất không cần vì làm tổn thương tế bào nguồn.

Liều lượng (Dose) tế bào nguồn cần thiết cho ghép tuỷ:

Liều lượng dùng cho ghép đồng loại (Allograít) và ghép tự thân (autograft) như sau:

Bảng: Liều lượng dùng cho ghép đồng loại

Máu cuống rốn và ngân hàng máu rốn

Một nguồn cung cấp tế bào nguồn có giá trị.

Đặc điểm sinh học máu cuông rốn

Chỉ có dấu ấn CD34+, các dấu ấn khác đều chưa xuất hiện.

Phản ứng nhanh, nhậy với chất kích thích như GM-CSF, G-CSF, IL-3.

Sô lượng CD34+ nhiều, cao hơn scí lượng ở tuỷ.

Khả năng sinh sản lớn gấp 4 - 5 có khi tối 10 so vói tế bào tuỷ

Tế bào có thẩm quyền miễn dịch (T lympho) ít, hoạt tính của T-CD8 rất thấp do đó GVHD yếu.

Nhiều progenitor: BFU-E, CFU-E, CFU-Meg, CFU-GEMM, CFU-GM.

Thu hoạch

Máu cuống ròn chống đông ACD - hỗn hợp với heparin theo tỷ lệ 10Ư heparin/ml ACD.

Tách bằng máy tự động, hoặc

Tách bằng ly tâm phân lớp.

Đánh giá sô lượng CD34 bằng phương pháp huỳnh quang và scí lượng GM / CFU bằng phương pháp nuôi cấy clon.

Bảo quản lạnh sâu (như trên).

Xây dụng ngân hàng tế bào nguồn máu rốn

Tách CD34.

Loại T.

Định HLA.

Bảo quản lạnh: bảo quản trong nitơ lỏng (liquid nitrogen) đạt được âm 196°c, có thể giữ được 4 - 5 năm trong điều kiện này.

Phương pháp ghép tuỷ tế bào nguồn

Ghép tuỷ tế bào nguồn, nghĩa là truyền tế bào nguồn vào máu như truyền máu, nhưng không dùng màng lọc máu, truyền chậm và dùng kim luồn vào tĩnh mạch trung tâm.

Bệnh có thể ghép tủy

Bệnh ung thư lỏng: All, AML, CLL CML, Hodgkin, nonHodgkin, myeloma.

Ung thư cứng: ung thư vú, tử cung, phổi.

Suy tuỷ, rối loạn sinh tuỷ (MDS).

Di truyền: Thalassemia, Glanzmann...

Suy giảm miễn dịch: AIDS, lupus.

Ghép tủy đống loài

Để ghép tủy đồng loài có kết quả, cần có hai điều kiện tối quan trọng đó là:

Tương đồng: ABO, HLA phải có ít nhất ba gen giông nhau, ít hơn thì khả năng đậu ghép rất khó khăn do bệnh ghép chống chủ gây nên.

Phòng bệnh ghép chống chủ, phòng thải ghép.

Tiến hành ghép tủy theo ba bước sau đây:

Chuẩn bị bệnh nhân:

Dùng hóa chất liều cao để tiêu diệt tế bào miễn dịch của cơ thể nhân. Thông thường có thể dùng một trong hai phương pháp:

Hoá chất đơn:

Cyclophosphamid : 120 mg/kg.

Etoposid: 60 mg/kg.

 Melphalan: 110 mg/kg.

Đa hoá chất:

Cytosa + cyclophosphamid : 3g/kg + 50 - 120mg/kg.

Busulphan + cyclophosphamid: 7mg/kg + 50 mg/kg.

Etoposid + cyclophosphamid : 30 -60kg + 1500 mg/kg.

Hoá chất phối hợp với ATG:

Cyclophosphamid 200mg/kg.

ATG = 90 mg/kg.

Hóa chất phối hợp với tia xạ toàn thân (TBI) để tiêu diệt tối đa tế bào miễn dịch.

Ghép tủy

Truyền tế bào nguồn vào tĩnh mạch trung tâm qua kim luồn catheter.

Chăm sóc sau ghép tủy

Phòng bệnh ghép chống túc chủ (GVHD):

Đây là phản ứng nguy hiểm nhất của ghép tủy đồng loài; Phòng GVHD bằng các thuốc sau đây:

Cyclosporin A.

Methotrexat.

Prednisolon.

ATG.

Điều trị hỗ trợ:

Chống nhiễm trùng, nấm: kháng sinh dự phòng, có phòng chăm sóc vô trùng.

Sử dụng hợp lý máu và các sản phẩm máu.

Chỉ định hợp lý máu và các sản phẩm máu.

Chế độ dinh dưỡng tốt, an toàn.

Sử dụng các íactor phát triển: GM-CSF, G-CSF.

Đánh giá kết quả

Theo dõi giám sát:

Theo dõi bệnh ghép chống chủ.

Nuôi cấy GM-CFU theo dõi tế bào ghép phát triển.

Xét nghiệm máu: hồng cầu, tiểu cầu.

Xét nghiệm sớm các nguy cơ dẫn đến không kết quả.

Tái phát (Relapse).

Nhiễm trùng: thường gặp nhiễm virus (CMV, Herpes EBV) nhiễm nấm, nhiễm trùng Gram (+), Gram (-).

Phát hiện các yếu tố dẫn đến kết quả xấu:

Bệnh không đông máu.

HLA không quan hệ huyết thống...

Úc chế miễn dịch không đầy đủ.

Tế bào T còn cao.

Sống tự do 3-5 năm cần dùng hoá chất ức chế phản ứng MD từng đợt:

Busulphan 16 mg/kg/ngày X 4 ngày.

Dùng tiếp cyclophosphamid 120 mg/kg/ngày X 2 ngày.

Phát hiện bệnh ghép chống chủ (GVHD)

Biểu hiện của bệnh ghép chống chủ cấp:

Bệnh thường xuất hiện sau khi ghép từ ngày 10 - 12, triệu chứng nổi bật là da, bệnh gút, bệnh gan, phổi và bệnh hệ miễn dịch.

Các biểu hiện ở da: rát đỏ, nốt phồng đỏ ở gan bàn tay, bàn chân, nách, cơ vai, mặt trong các cơ gấp...

Biểu hiện ở đường chuyển hoá: thường tổn thương gan làm bilirubin tăng, men gan tăng, tổn thương tế bào biểu mô đường tiêu hoá. Do đó dẫn đến rối loạn chuyển hóa các chất.

Bệnh gút: đau, buốt các đầu ngón chân...

Xét nghiệm tế bào T-CD4+ và T-CD8+, các cytokin IL-2, INF... các cytokin này sẽ làm tăng quá trình tổn thương tổ chức.

Biểu hiện của GVHD mạn:

Ghép đồng loài chọn lọc HLA có tới 20-30%, có tác giả thông báo 60% có GVHD mạn... Nguyên nhân chính vẫn là do tế bào T lympho của tế bào ghép chưa được làm sạch. Thường 40 ngày sau, có khi sau 1 năm mối xuất hiện. Các biểu hiện lâm sàng vẫn chủ yếu ở da và bệnh gan. Gan có thể bị xơ gan, viêm gam mạn tiến triển, tổn thương mắt, niêm mạc.

Ngoài ra bệnh ghép chống chủ còn biểu hiện ở thận như hội chứng tan máu sau ghép, đái máu,... Bệnh ở phổi với các biểu hiện viêm phổi,... bệnh nội tiết, thường có hội chứng tăng nội tiết tố, biểu hiện lâm sàng rất ít, khám nội tiết có thể gặp 50 - 60% các trường hợp, đục nhân mắt (cataracts) gặp 10 - 20%, bệnh xương thường gặp là loãng xương, bệnh ung thư thứ phát thường do hậu quả của các virus tấn công vào cơ thể nhất là EBV gây u lympho.

Phòng và điều trị bệnh ghép chống chủ

Dự phòng:

Loại T lympho khỏi tế bào nguồn ghép

Úc chế phân bào T lympho:

Prednisolcn

Cyclosporin A + ATG

Điểu trị:

Dùng các thuốc chống phân bào T lympho, kèm theo chăm sóc sốt, nhiễm trùng, chăm sóc chức phận gan thận.

Tiên lượng GVHD: nhìn chung nếu GVHD xuất hiện thì tiên lượng rất xấu.

Ghép tủy tự thân

Dùng tế bào nguồn của bệnh thép lại cho bệnh nhân. Trường hợp này không cần lựa chọn HLA. Nhưng vấn đề loại bỏ tế bào ung thư lại trở nên cần thiết. Công việc được tiến hành theo các bước sau đây:

Chuẩn bị tế bào nguồn

Thu hoạch tế bào CD34 từ máu:

Huy động tế bào nguồn: sau điều trị hóa chất tế bào leukemia bị tiêu diệt, tiến hành tiêm G-CSF, sau đó thu hoạch tế bào nguồn

Làm sạch tếbào ung thư (tếbào lơxêmi) bằng hai cách:

Sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu lơxêmi, diệt tế bào ung thư trước khi truyền.

Tạo kháng thể chống lơxêmi ngay trong bản thân bệnh nhân tự ghép. Tế bào ung thư còn lẫn trong huyền dịch tế bào gốíc nhưng đã bị bất hoạt bởi kháng thể đặc hiệu khi truyền vào cơ thể nhận, chúng trở thành kháng nguyên lạ với cơ thể, cơ thể có khả năng đáp ứng miễn dịch, tạo kháng thể chổng tế bào leukemia. Đó là hình thức loại bỏ tế bào ung thư.

Đông lạnh tế bào nguồn cũng có tác dụng loại bỏ tế bào leukemia (tế bào leukemia dễ chết).

Bảo quản: đông lạnh ở nhiệt độ - 180°c, hoặc truyền ngay sau bảo quản ở 4°c trong 3 ngày.

Chuẩn bị bệnh nhân và ghép tủy

Hóa trị liệu liều cao: Tiêu diệt triệt để tế bào ung thư sử dụng các thuốc: cyclophosphamid; caromustin; melfalan; etoposid; cytosin-arabinosid; thioguanin.

Tia xạ liều toàn thân (TBI).

Ghép tủy: Truyền tế bào tủy (tế bào CD34+) vào tĩnh mạch trung tâm đã đặt trước catheter.

Làm tan đông rất nhanh.

Truyền tủy.

Tai biên có thể có khi truyền tủy: buồn nôn, nôn, đau bụng, khó thở, tăng HA, rôi loạn chức phận thận do các thành phần tế bào đông tan giải phóng ra.

Chăm sóc sau ghép tủy

Hô trợ: các sản phẩm máu, kháng sinh chống nhiễm trùng, dinh dưỡng, các factor phát triển.

Theo dõi sự phát triển của tế bào tuỷ ghép.