Khảo sát định tính immunoglobulin

Huyết thanh

Tất cả các mẫu huyết thanh người lớn được đề nghị định lượng Ig nên được sàng lọc trước bằng điện di protein huyết thanh để tìm sự hiện diện của paraprotein (các dải đơn clôn).

Nền đỡ thường dùng nhất là một màng cellulose acetate. Tấm màng ướt được cho vào hộp điện di và những dung giấy thấm giúp cho việc cung cấp liên tục dung dịch đệm. Các mẫu huyết thanh được cho lên màng ở phía cực âm và một dòng điện được cho qua màng trong 45 phút. Sau đó lấy màng ra, và các dải protein có thể thấy được nếu chúng ta cho nhuộm với thuốc nhuộm thích hợp (Hình 12.4). Chúng ta luôn nhớ phải cho chạy một mẫu huyết thanh bình thường song song với huyết thanh thử để dễ so sánh.

Những dải đơn clôn (dải M) lạ có thể xuất hiện ở một vị trí nào đó trên màng điện di và chúng ta cần tách chúng ra để khảo sát sâu hơn. Trên màng điện di có thể xuất hiện những “dải giả” (false band), đó có thể là sản phẩm của hemoglobin (thấy rõ khi mẫu nghiệm có màu hồng) hoặc của fibrinogen (khi mẫu là huyết tương hoặc là huyết thanh nhưng máu để đông không được hoàn toàn). Do có nhược điểm là các IgG đã bị tủa trong những mẫu đông lạnh có thể đọng lại tại gần vị trí lỗ chứa mẫu. Do đó, điều quan trọng khi làm xét nghiệm này cần phải gửi mẫu nghiệm đi sớm và máu phải đông hoàn toàn.

Hình. Nguyên lý của điện di protein huyết thanh.

Các dải M có thể định lượng bằng một dụng cụ gọi là mật độ kế (densitometer); dụng cụ này đọc được độ đậm đặc của thuốc nhuộm bắt màu vào các dải và cho ta một biểu đồ tương ứng với các dải điện di (Hình 12.5). Tỉ lệ của mỗi loại protein riêng được tính thành phần trăm so với tổng lượng protein có được trong mẫu nghiệm; tỉ lệ bách phân này có thể chuyển ra số lượng tuyệt đối (g/lít) bằng cách tính đơn giản khi ta biết được nồng độ của protein toàn thể trong huyết thanh. Đo mật độ là một phương pháp quan trọng để định lượng protein trong các dải đơn clôn, nhất là khi chúng ta khảo sát các mẫu kép có lẩn nhiều immunoglobulin đa clôn.

Hình. Phân tích điện di protein bằng mật độ kế để định lượng dải M (A= albumin)

Khi một giải M được phát hiện trên điện di protein, mẫu huyết thanh đó cần phải chạy điện di miễn dịch hoặc làm phản ứng cố định bổ thể để xác định bản chất của dải. Nguyên tắc của điện di miễn dịch cũng giống như điện di protein huyết thanh nhưng người ta dùng gel thạch để làm chất nền. Sau khi tách các thành phần protein huyết thanh bằng điện di, một đường rãnh sẽ được cắt giữa các lỗ chứa huyết thanh và kháng huyết thanh đặc hiệu được cho vào rãnh này (Hình 12.6); những protein nào có phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu sẽ cho ta một cung kết tủa. Sau 12-24 giờ, các protein không tủa sẽ được rửa sạch khỏi gel và các cung tủa được đem nhuộm để dễ thấy và đọc kết qủa. Trong các la-bô miễn dịch của các bệnh viện hiện nay, người ta thường dùng các huyết thanh đặc hiệu cho IgG, IgM, IgA hoặc các tiểu lớp của chúng, cho các chuỗi nhẹ kappa và lambda tự do cũng như cố định trong công tác chẩn đoán. Các immunoglobulin đa clôn bình thường cho ra những tủa dài, trơn láng khi phản ứng với  kháng huyết thanh đặc hiệu trong phương pháp xét nghiệm này. Một protein đơn clôn thì cho một cung tủa dứt khoát và gãy gọn hơn.

Hình. Nguyên lý của điện di miễn dịch. (b là hình phóng đại của a).

Để định tính một giải M người ta có thể cùng phương pháp cố định miễn dịch (immunofixation). Nhiều  mẫu của  huyết thanh thử trước hết được cho điện di trên celluose acetate hoặc gel thạch (Hình 12.7). Sau đó, kháng huyết thanh đặc hiệu đối với IgG, IgA, IgM hoặc các tiểu lớp của chúng cũng như đối với các chuỗi kappa và lambda cố định được cho tác dụng với các mẫu nghiệm đã điện di bằng cách nhúng màng cellulose acetate vào từng loại kháng huyết thanh.

Hình. Định tính một dải M bằng phương pháp cố định miễn dịch.

Trong ví dụ này, dải M được tìm thấy trên giấy cellulose acetate là một Ig thuộc týp κ.

Trong trường hợp không có bất thường chuỗi nặng, kháng huyết thanh chuỗi nhẹ tự do (tức không phản ứng với chuỗi nhẹ “cố định” vào chuỗi nặng) sẽ cho chúng ta biết giải M có phải là của chuỗi nhẹ đơn clôn tự do hay không. Rất hiếm khi có một giải M phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu chuỗi nhẹ “cố định” mà không phản ứng với chuỗi nhẹ “tự do” cùng týp; và nếu điều đó xảy ra thì dải M là một paraprotein IgD hoặc IgE, bởi vì IgG, IgA và IgM đã được loại trừ trên gel đầu tiên. Một bất thường xảy ra với chỉ kháng huyết thanh chuỗi nặng nói lên một bệnh chuỗi nặng hiếm gặp.

Sự tăng cao hàm lượng immunoglobulin huyết thanh buộc chúng ta phải đo độ quánh huyết thanh tương đối; kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian đủ cho một thể tích huyết thanh đã cho đi qua một ống mao quản, và so sánh với thời gian cho nước đi qua. Độ quánh huyết thanh tương đối bình thường có trị số từ 1,4 - 1,8. Triệu chứng lâm sàng của tăng độ quánh xuất hiện khi trị số này vượt quá 4,0.

Nếu như huyết thanh còn mới, sự lắng đọng nhiều protein ở phần gốc điện di nói lên khả năng hiện diện của cryoglobulin. Cryoglobulin là những immunoglobulin có thể.

Nước tiểu

Xét nghiệm nước tiểu là điều cần thiết trong trường hợp bệnh đa u tủy, trong một số bệnh khác có thấy dải M trong huyết thanh khi điện di, trong thiếu máu giảm gammaglobulin không rõ nguyên nhân và trong nhiễm tinh bột.

Sự tổng hợp immunoglobulin bình thường đi kèm với sự sản xuất một lượng thừa chuỗi nhẹ đa clôn tự do. Các chuỗi nhẹ này được bài tiết ra nước tiểu và chúng ta có thể phát hiện chúng dưới dạng vết ở tất cả mọi người. Bệnh nhân bị tổn thương thận thì sẽ tiết một lượng lớn chuỗi nhẹ tự do đa clôn trong nước tiểu.

Chuỗi nhẹ đơn clôn tự do (tức protein Bence Jones) đã được đặt tên của người đầu tiên mô tả tính chất nhiệt học đặc biệt của nó là kết tủa khi cho hâm nóng dung dịch lên đến 560C, nhưng nếu cho nóng hơn thì tủa lại tan ra. Tuy nhiên, phương pháp phát hiện cổ điển này chỉ phát hiện được khoảng 40% chuỗi nhẹ tự do trong nước tiểu. Cả phương pháp thường qui định lượng protein nước tiểu toàn phần lẫn thử nghiệm Clinistix đều

không thể phát hiện chuỗi nhẹ tự do. Hiện nay, xét nghiêm thường qui đối với trường hợp nghi ngờ có protein Bence Jones nước tiểu gồm 3 giai đoạn: (1) cô đặc nước tiểu; (2) điện di cellulose acetate để tìm sự hiện diện của dải M; và (3) cố định miễn dịch hoặc điện di miễn dịch để xác nhận dải M được cấu tạo bởi chuỗi nhẹ kappa đơn clôn hoặc chuỗi nhẹ lambda đơn clôn. Sự bài tiết toàn bộ paraprotein của thận tổn thương có thể cho một kết quả dương tính giả, do đó chúng ta phải tìm bản chất của chuỗi nhẹ tự do của dãi M để xác nhận kết quả.

Dịch não tủy

Điện di dịch não tủy là một xét nghiệm có ích đối với chẩn đóan bệnh xơ hóa nhiều chỗ và các bệnh mất myelin khác. Cũng như trong huyết thanh, immunoglobulin của dịch não tủy cũng nằm ở vùng gamma. Nhưng ngược với huyết thanh, IgG thường tạo nên những dải thiểu clôn; có nghĩa là một vài dải rời rạc chứ không phải là một đám lan toả. Các dải thiểu clôn không thể phát hiện được bằng điện di thường qui dịch não tủy chưa cô đặc, do đó cần cô đặc dịch não tủy (80 lần) để có thể cho những dải thấy được. Độ nhạy của phương pháp  có thể được tăng cường bằng cách nhuộm đặc biệt như nhuộm bằng kháng huyết thanh đánh dấu enzyme hoặc bằng dung dịch có tăng cường bạc. Tuy nhiên, phương pháp nhạy và đáng tin cậy nhất là điện di dịch não tủy không pha loãng trên gel acrylamide. Môi trường gel này sẽ tách các protein theo trọng lượng phân tử.